核酸純化試劑是我們實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn),常說(shuō)的核酸純化是指分離核酸物質(zhì)DNA/RNA和蛋白質(zhì)、多酚、多糖等其他高分子物質(zhì),那么,下面一起了解下核酸純化試劑使用方法和注意事項(xiàng)吧!
01、保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性
02、盡量排除其他分子的污染,保證核酸樣品的純度
細(xì)胞分裂
1、物理作用:低滲透分解、超聲波分解、凍融分解、研磨、勻漿等。 用玻璃珠、超聲波、研磨等方法破碎細(xì)胞;
2、化學(xué)作用: CTAB法、SDS處理等;
烷基三甲基溴銨是陰離子清除劑,溶解細(xì)胞膜,與核酸形成復(fù)合體。 該復(fù)合體可溶于高鹽溶液,可用有機(jī)溶劑提取,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后,加入乙醇沉淀,從而分離核酸。
堿分解法是質(zhì)粒DNA的常用提取方法。 染色體DNA遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA分子,染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)鍵環(huán)狀分子。 用堿處理DNA溶液時(shí),線狀染色體DNA容易變性。 共價(jià)鍵環(huán)狀質(zhì)粒DNA恢復(fù)中性PH后恢復(fù)天然構(gòu)象,變性染色體DNA的片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞片段結(jié)合沉淀,成為具有復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA
3、酶作用:加入溶菌酶和蛋白酶等
在純化具有細(xì)胞壁的微生物樣本時(shí),加入溶菌酶等溶解細(xì)胞壁,進(jìn)行以下分離和純化。 蛋白酶k是從白色中分離出來(lái)的強(qiáng)力蛋白溶解酶,用于清除核酸酶和其他蛋白污染。
分離和純化
1、加入濃鹽溶液:鹽濃度不同的溶液中,DNA、RNA的溶解度不同
2、加入SDS :將核酸從蛋白質(zhì)上游分離出來(lái)
3、萃?。菏杷缘鞍自谟袡C(jī)相中,核酸殘留在上層水相中
4、硅膠吸附:硅膠膜吸附核酸
5、磁珠吸附:利用磁珠選擇性吸附核酸
分離方法的優(yōu)缺點(diǎn):
1、RNA回收效率高、耗時(shí)長(zhǎng)、不利于自動(dòng)化,也不利于基因組DNA污染
2、鹽析法:產(chǎn)量低,不適合自動(dòng)提取
3、硅膠吸附法:純度高、簡(jiǎn)單方便、無(wú)毒性、可自動(dòng)化
4、磁珠吸附法:產(chǎn)量高、純度好,可以實(shí)驗(yàn)特異種的核酸分離,可以自動(dòng)化
5、加熱煮沸法:只用于純化DNA,成本低、純度低、產(chǎn)量低
清洗和溶解
清洗:進(jìn)一步除去雜質(zhì),通常使用75%乙醇
溶解:一般使用無(wú)核酸酶水或TE緩沖液